• Высокочувствительная камера — инструмент для обнаружения сверхслабых световых сигналов

            В системе используется высокочувствительная ПЗС-камера высокого разрешения исследовательского класса с сверхвысокой квантовой эффективностью, что позволяет максимально повысить чувствительность обнаружения слабых световых сигналов. Камера оптимизирована для флуоресцентной и биолюминесцентной визуализации растений in vivo и применяется в таких областях, как исследования устойчивости и селекция растений, изучение регуляции экспрессии генов, анализ биологических ритмов растений, а также исследования фотопериодизма и фотоиндукции.

• Технология высокоскоростного объектива

            Использование сверхсветосильного объектива с фиксированным фокусом (диафрагма F < 0.9) значительно увеличивает скорость сбора светового сигнала, сокращает время экспозиции и снижает шумы, возникающие при длительной съемке, что эффективно повышает соотношение сигнал/шум.

• Полноспектральная флуоресцентная визуализация — семиканальное возбуждение в УФ-ИК диапазоне

            Система оснащена двумя LED-платами с высокомощными источниками возбуждения, обеспечивающими семь каналов возбуждения и охват полного спектра. В сочетании с высококачественными фильтрами это сводит к минимуму помехи от фоновой флуоресценции и автофлуоресценции образцов, удовлетворяя потребности любых экспериментов по флуоресцентной визуализации in vivo с различными типами меток.

• Широкоформатная визуализация 400 мм — работа с различными образцами и высокопроизводительный скрининг

            Система для визуализации растений in vivo BioVivo™ серии G обеспечивает поле обзора до 400*400 мм с бесступенчатой регулировкой точностью 1 мм. Это позволяет проводить непрерывное наблюдение за полным жизненным циклом растений — от прорастания семян и роста проростков до взрослых растений, осуществлять высокопроизводительный скрининг мутантных линий (одновременная визуализация до 16 растений в горшках), исследовать крупные растения (поддержка образцов высотой ≥ 60 см).

• Всесторонний контроль условий для растений — температура, влажность, освещение

            Внутри светонепроницаемой камеры осуществляется контроль температуры и влажности окружающей среды. Система оснащена терморегулируемым предметным столиком с диапазоном 10–45°C для исследований температурного стресса.

            Комбинация 8 спектральных диапазонов (УФ-видимый-ближний ИК) имитирует солнечный свет; интенсивность и продолжительность отдельных спектров и их комбинаций свободно регулируются. Интенсивность освещения достигает 26 000 люкс (на расстоянии 400 мм) — идеально для изучения биологических ритмов и фотопериодизма растений.

• Профессиональное интеллектуальное ПО для съемки, обработки и анализа изображений

            Программное обеспечение Biovivo LabEasy™ разработано для максимального упрощения экспериментов по визуализации in vivo: простой и интуитивный интерфейс, быстрое освоение; получение качественных изображений одним нажатием; удобная обработка изображений, быстрое отделение фона и идентификация сигнала; точный количественный анализ ROI; анализ множества изображений; функция мультиспектрального флуоресцентного анализа для разделения множественных флуоресцентных сигналов и эффективного удаления фонового шума; поддержка визуализации двухцветной и многоцветной флуоресцентной маркировки.

• Направления применения системы визуализации растений in vivo

1. Исследования устойчивости растений к стрессам и селекция
2. Изучение взаимодействия белков методом транзиентной экспрессии в табаке
3. Исследование регуляции экспрессии генов в растениях in vivo
4. Изучение передачи сигнальных путей в растениях in vivo
5. Исследования роста и развития растений
6. Фенотипирование растений
7. Изучение биологических ритмов растений
8. Исследования фотопериодизма растений
9. Изучение светоиндуцируемых процессов в растениях
10. Исследования болезней растений и иммунных реакций

            Уже в первые два десятилетия XX века и даже раньше, в XIX веке, ученые обнаружили, что фокусировка на относительно простых организмах позволяет частично разрешить загадки явлений развития. Например, при раскрытии законов наследственности в живой природе Мендель использовал в качестве экспериментального материала горох, а Морган выбрал плодовую мушку дрозофилу. В их исследованиях горох и дрозофила имели меньше клеток, их структура была более однородной, а изменения было легче наблюдать.

            В результате эволюции клеточные формы жизни обладают значительным сходством в фундаментальных моделях развития, и многие базовые механизмы жизнедеятельности схожи у различных биологических видов на Земле. Поэтому возможно использование видов, находящихся на относительно низких ступенях лестницы биологической сложности, для изучения общих закономерностей развития. Это особенно верно, когда общие характеристики морфогенеза и изменений обнаруживаются у организмов с различными особенностями развития, что позволяет установить универсальные принципы развития. Изучение таких организмов помогает нам раскрыть те или иные универсальные закономерности жизненных явлений и понять общие законы, управляющие живым миром. Таким образом, эти специально отобранные организмы и получили название «модельные организмы». Выбор конкретного организма в качестве модельного зависит, прежде всего, от научной задачи, которую ставит перед собой исследователь, а также от поиска вида, наиболее подходящего для решения этой задачи.

            В начале XX века Морган выбрал плодовую мушку Drosophila melanogaster в качестве объекта исследования. На основе этих работ была создана хромосомная теория наследственности, заложившая фундамент классической генетики и положившая начало использованию дрозофилы в качестве модельного организма. Ученые не только подтвердили на дрозофиле законы Менделя, но и открыли сцепленное с полом наследование мутации белых глаз, сформулировали принцип линейного расположения генов в хромосомах и закон сцепления и кроссинговера. В 1933 году Морган был удостоен Нобелевской премии за эти достижения. Расшифровка генома дрозофилы, завершенная в 2000 году, укрепила ее статус в качестве важнейшего модельного животного для изучения генетики и биологии развития.

            С 1965 года ученый Сидней Бреннер ввел нематоду Caenorhabditis elegans в сферу исследований молекулярной и биологии развития. В 1983 году была полностью описана клеточная линия червя от оплодотворенной яйцеклетки до взрослой особи, что стало вехой в истории биологии развития. Впоследствии C. elegans нашла широкое применение в исследованиях эмбрионального развития, определения пола, апоптоза, поведения и нейробиологии, а также стала важнейшим модельным организмом в изучении старения и продолжительности жизни.

            Данио-рерио , обладает такими характеристиками, как высокая плодовитость, внешнее оплодотворение и развитие, прозрачность эмбрионов, короткий цикл достижения половой зрелости, малые размеры и простота содержания, что делает ее идеальным выбором для изучения механизмов эмбрионального развития, функций генов и патогенеза заболеваний. Гладкая шпорцевая лягушка. Ее ооциты отличаются крупными размерами и большим количеством, что удобно для микрохирургических манипуляций. Кроме того, из них можно создавать биологически активные бесклеточные системы, пригодные для биохимического анализа, что обеспечивает им незаменимую роль в исследованиях биологии развития.

            Главным модельным животным, безусловно, является лабораторная мышь! Благодаря своим небольшим размерам, покладистому характеру, простоте в содержании, а также сходству процессов развития и анатомического строения тканей с человеческими, мыши начали использоваться в анатомии и экспериментах на животных еще с XVII века. В результате длительной селекции и разведения в искусственных условиях к настоящему времени выведены тысячи независимых аутбредных и инбредных линий. Лабораторная мышь стала важнейшим модельным организмом для расшифровки функций человеческих генов и изучения болезней человека, а также наиболее подробно изученным млекопитающим в мире для научных экспериментов. Кроме того, гены мыши обладают высокой степенью гомологии с генами человека: 99% генов человека имеют соответствующие гены в геноме мыши. Мышь широко используется в качестве модельного организма в биомедицинских исследованиях и является наиболее детально изученным млекопитающим для экспериментов в современном мире.

            Выше были представлены модельные организмы из царства животных, которые мы обычно называем модельными животными. Существуют ли также модельные растения? Ответ утвердительный. В современных ботанических исследованиях в качестве модельных растений наиболее часто используются резуховидка Таля, табак, томат, рис и другие, причем каждый из них служит своим особым исследовательским целям.

            Открывает ряд модельных растений резуховидка Таля. Она принадлежит к отделу покрытосеменных, классу двудольных и является представителем семейства крестоцветных. Само по себе это растение не обладает большой экономической ценностью. Однако его малые размеры, высокая семенная продуктивность и короткий жизненный цикл; хорошо различимые морфологические признаки, удобные для наблюдения мутантные фенотипы, а также самоопыляемость делают его исключительно удобным объектом. Геном резуховидки Таля считается небольшим для высших растений (около 125 миллионов пар оснований и 5 пар хромосом), гены характеризуются высокой степенью гомозиготности. Обработка физико-химическими факторами приводит к высокой частоте мутаций, что позволяет легко получать мутанты с дефектами различных метаболических функций. Благодаря этому резуховидка Таля стала идеальным модельным организмом для изучения генетики, клеточного развития и молекулярной биологии цветковых растений, заслужив среди ученых титул «дрозофилы в мире растений».

            История изучения резуховидки Таля восходит к XVI веку. В 1943 году Лайбах подробно обосновал ее преимущества в качестве модельного организма, что способствовало проведению первой Международной конференции по резуховидке Таля в Германии в 1965 году. Однако ее активное использование в качестве модельного организма началось примерно в последние двадцать лет того века. В 1986 году лаборатория Мейровица впервые сообщила о клонировании гена резуховидки Таля. В 1988 году была опубликована первая RFLP-карта ее генома. В последующие несколько лет последовали сообщения о клонировании генов мутантов с T-ДНК-вставками и клонировании генов на основе генетических карт. В 2000 году была завершена работа по определению полной нуклеотидной последовательности ее генома, сделав резуховидку Таля первым растением с полностью расшифрованным геномом.

            Томат, или помидор, — это однолетнее или многолетнее травянистое растение семейства пасленовых, рода Solanum. Высота растения составляет 0.6–2 метра, вся его поверхность покрыта липкими железистыми волосками, и оно обладает сильным характерным запахом. Стебель склонен к полеганию. Листья перисто-сложные или перисто-рассеченные. Длина цветоноса — 2–5 см, соцветие обычно состоит из 3–7 цветков. Чашечка и венчик колесовидные. Плод — сочная мясистая ягода, сплюснуто-шаровидной или почти шаровидной формы, с желтыми семенами. Период цветения и плодоношения приходится на лето и осень. Благодаря относительно небольшому размеру генома, короткому жизненному циклу, способности к самоопылению, наличию хорошо отработанной системы генетической трансформации и ясной генетической базе, а также более отдаленному родству с другими модельными растениями (такими как резуховидка Таля или рис), томат стал классическим модельным организмом для изучения процессов развития и созревания плодов.

            Рис, как одна из важнейших зерновых культур в мире, играет все более значимую роль в качестве модельного растения для изучения злаков. Это обусловлено его относительно небольшим геномом, известной геномной последовательностью, хорошо отработанной системой Agrobacterium-опосредованной генетической трансформации, а также высокой степенью гомологии (генетического сходства) с другими зерновыми культурами. Табак — это не только важная экономическая культура, но и один из наиболее ценных материалов для научных исследований. Многие инновационные исследования проводились именно на табаке. Значительная часть ботанических знаний, таких как фотопериодизм, питание растений, фотосинтез, фотодыхание, органический метаболизм, а также исследования вирусов и трансгенных организмов, получена именно из табака. Ни одно другое растение не было изучено наукой так глубоко, как табак. Он является модельным организмом для молекулярной биологии и генной инженерии и по праву заслужил титул «лабораторной мыши растительного царства».

            Помимо упомянутых выше модельных животных и растений, в семейство модельных организмов, конечно же, входят и микроорганизмы. Кишечная палочка и дрожжи являются ключевыми материалами для изучения генетики микроорганизмов и широко используются в качестве модельных организмов в микробиологических исследованиях. В будущем, по мере развития исследований в области наук о жизни, семейство модельных организмов, несомненно, будет продолжать расти.

Agrobacterium-опосредованная генетическая трансформация растений

             Метод Agrobacterium-опосредованной трансформации является высокоэффективным методом генетической трансформации, характеризующимся широким спектром подходящего биологического материала, высокой частотой трансформации, большим процентом одно-копийных вставок и стабильностью трансформантов, что открывает широкие перспективы для его применения.

             Agrobacterium — это грамотрицательная бактерия, широко распространенная в почве. В естественных условиях она способна хемотаксически инфицировать поврежденные участки у большинства двудольных и некоторых голосеменных растений, вызывая образование корончатых галлов или «волосатых» корней. Клетки Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes содержат область Т-ДНК. После проникновения в растительную клетку через рану, агробактерия может интегрировать эту Т-ДНК в геном растения. Таким образом, агробактерия представляет собой природную систему генетической трансформации растений. Встраивая целевой ген в модифицированную область Т-ДНК, можно использовать инфекционный процесс агробактерии для переноса и интеграции чужеродного гена в растительные клетки. Затем с помощью технологий клеточной и тканевой культуры воспроизводят трансгенные растения. В лабораторных условиях данным методом удалось осуществить трансформацию организмов, не являющихся естественными хозяевами агробактерии, таких как грибы, однодольные растения, голосеменные и даже животные клетки. По сравнению с традиционными методами, такими как PEG-опосредованная трансформация протопластов, электропорация или метод с использованием LiAC, Agrobacterium-опосредованная трансформация обладает следующими преимуществами: широкий спектр подходящего материала, высокая частота трансформации, большой процент одно-копийных вставок и стабильность трансформантов. Это один из наиболее широко применяемых методов.

Технология генетической трансформации табака

I. Подготовка

1. Растения табака, выращенные в стерильной культуре (в течение 30 дней)
2. Пинцеты, ножницы, скальпели, чашки Петри (диаметром 12 см) с 5-6 слоями фильтровальной бумаги

II.Процесс трансформации

(1) Приготовление бактериальной суспензии

За день до эксперимента отбирают единичную колонию Agrobacterium, предназначенную для трансформации, и инокулируют в 10 мл среды LB (с добавлением рифампицина и канаминина по 50 мг/л каждый), после чего культивируют на протяжении ночи.

(2) Инфицирование табака агробактерией

1. Приготовление среды для совместной культивации: среда MS + NAA (0.1 мг/л) + 6-BA (1.5 мг/л).
2. С помощью ножниц и пинцета со стерильных растений табака срезают хорошо развитые листья и помещают их в стеклянную чашку Петри.
3. В чашке Петри листья скальпелем нарезают на сегменты размером приблизительно 0.5–1 см². Лезвием быстро проводят по листу, отсекая кусочки, стараясь получить ровные срезы. Пинцетом нарезанные листовые сегменты переносят в суспензию агробактерии с OD 0,4–0,6 и выдерживают в ней в течение 8–10 минут.
4. Суспензию сливают, а листовые сегменты пинцетом переносят на фильтровальную бумагу в чашке Петри для удаления избытка бактериальной жидкости. Дают поверхности листьев высохнуть в течение некоторого времени в ламинарном боксе.
5. Листовые сегменты с удаленной суспензией помещают на среду для совместной культивации и культивируют в темноте при 25°C в течение трех дней.

(3) Дифференциация и отбор трансформированных культур табака

1. Приготовление среды: MS + 1.5 мг/л 6-BA + 0.1 мг/л NAA + 30 мг/л гигромицина + 100 мг/л цефазолина.
2. Листовые сегменты после трех дней совместной культивации переносят на приготовленную среду, стараясь обеспечить их плотный контакт с поверхностью среды и оставляя между сегментами некоторое расстояние. Культивирование проводят при освещении и температуре 25°C.
3. После 2–3 недель культивирования при освещении образуются побеги табака. Побеги срезают и переносят на среду для укоренения и усиления роста (MS + 0.1 мг/л 6-BA + 0.01 мг/л NAA + 30 мг/л гигромицина + 100 мг/л цефазолина).
4. Примерно через неделю отбирают побеги табака, образовавшие корни, и переносят их на среду для укоренения (MS + 30 мг/л гигромицина + 100 мг/л цефазолина).
5. Проводят ПЦР-анализ побегов табака для подтверждения трансформации.

             Технология визуализации живых организмов (in vivo) становится все более важным инструментом в исследованиях фитопатологии и взаимодействий «растение-вредитель», позволяя расшифровывать механизмы инфицирования патогенами, иммунные реакции хозяина и динамику взаимоотношений между вредителями и растениями. Благодаря своим неинвазивности, возможности динамического наблюдения в реальном времени и высокому разрешению, эта технология позволяет исследователям отслеживать распространение патогенов, защитные реакции растения-хозяина и поведение вредителей — от молекулярного до органного уровня. Ниже подробно рассматриваются ее применения и стоящие перед ней вызовы с нескольких точек зрения:

I. Обзор технологии визуализации in vivo

             Технология визуализации in vivo позволяет осуществлять динамическую визуализацию патогенов, вредителей и связанных с ними физиологических процессов в растении путем применения флуоресцентных маркеров, биолюминесценции или оптических зондов в сочетании с микроскопическими или макроскопическими системами визуализации (такими как IVIS, конфокальная микроскопия). К часто используемым методам относятся:

• Флуоресцентная визуализация: маркировка патогенов (например, патогенные грибы, меченные GFP), сигнальных молекул иммунной системы растений (например, зонды ROS), поведения вредителей (например, отслеживание путей питания насекомых с помощью флуоресцентных меток).
• Биолюминесцентная визуализация: использование патоген-специфичных промоторов для управления экспрессией люциферазы (например, репортерная система PR1::LUC, активируемая при патогенной инфекции).
• Визуализация флуоресценции хлорофилла: оценка повреждения фотосинтетического аппарата после заражения патогеном (например, снижение эффективности Фотосистемы II при заражении фитофторозом).
• Визуализация в ближнем ИК-диапазоне: проникновение через ткани листа для отслеживания колонизации патогена в глубинных слоях (например, флуоресцентная маркировка бактерий в ксилеме).

II. Применение в фитопатологических исследованиях

1. Динамическое отслеживание процесса патогенной инфекции

Колонизация и распространение патогена:

• Использование патогенов, меченных GFP/RFP (например, Colletotrichum, фитофтора), для наблюдения в реальном времени за путями их распространения от точек проникновения (устьица, раны на листьях) в ткани растения-хозяина.
• Применение покадровой съемки для выявления системного перемещения патогена по ксилеме или флоэме (например, движение бактерий Xanthomonas по сосудистой системе).

Визуализация структур инфекции:

• Наблюдение с помощью конфокальной микроскопии за формированием прикрепительных клеток патогена (например, аппрессориев и гаусторий ржавчинных грибов) и их взаимодействием с клеточной стенкой растения.

2. Анализ иммунного ответа хозяина

Мониторинг ранних защитных сигналов:

• Использование флуоресцентных зондов (например, H2DCFDA) для детекции в реальном времени всплеска активного кислорода (ROS), вызванного патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (PAMP).
• Применение кальциевых зондов (например, GCaMP) для регистрации колебаний кальциевой сигнализации, вызванных патогенной инфекцией (например, пиковые значения Ca²⁺, вызванные бактериальным флагеллином).

Динамика экспрессии иммунных генов:

• Использование флуоресцентных репортерных систем (например, NPR1::GFP) для отслеживания пространственно-временных характеристик активации сигнального пути салициловой кислоты.
• Применение биолюминесцентной визуализации (например, LUC, управляемая промотором транскрипционного фактора WRKY) для количественной оценки интенсивности индукции иммунных генов.

3. Изучение механизмов взаимодействия патогена и хозяина

Исследование функций эффекторных белков:

• Мечение эффекторных белков патогена (например, эффекторов RXLR у оомицетов) для визуализации их внутриклеточной локализации в растении-хозяине (например, нацеливание на ядро или плазматическую мембрану).
• Применение метода бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) для определения сайтов взаимодействия эффекторных белков с белками-мишенями хозяина.

Оценка устойчивости растений к болезням:

• Комбинация визуализации флуоресценции хлорофилла с маркировкой патогена для быстрого скрининга устойчивых мутантных линий растений (например, линий резуховидки Таля, устойчивых к мучнистой росе).

III. Применение в мониторинге вредителей и исследованиях их поведения

1. Отслеживание путей питания и распространения вредителей

Флуоресцентная маркировка насекомых:

• Скармливание насекомым пищи, содержащей флуоресцентные красители (например, раствор сахарозы, меченный Cy5), с последующей макрофлуоресцентной визуализацией для отслеживания мест питания и путей перемещения тли, белокрылки и других вредителей по растению.

Исследование насекомых-переносчиков патогенов:

• Использование визуализации in vivo для наблюдения за репликацией и транспортом вирусов в организме насекомых-переносчиков (например, у табачной белокрылки), например, путем мечения вирусного капсидного белка.

2. Динамика взаимодействий «растение-вредитель»

Сигналы растений, индуцируемые повреждениями насекомых:

• Использование GFP-меченной репортерной системы для сигнального пути жасмоновой кислоты (JA) (например, JAZ1::GFP) для мониторинга в реальном времени системной передачи JA-сигнала после повреждения, нанесенного насекомыми.

Регуляция поведения вредителей:

• Применение визуализации в ближнем ИК-диапазоне для регистрации суточной активности ночных вредителей (например, гусениц совок) и их реакции на летучие вещества растений.

3. Оценка эффективности мер защиты растений от вредителей и болезней

Визуализация механизма действия пестицидов:

• Использование флуоресцентно меченных пестицидов (например, инсектицидов, меченных родамином B) для отслеживания их поглощения и распределения в растении.
• Применение визуализации in vivo для оценки эффективности инфицирования вредителей биопестицидами (например, энтомопатогенными нематодами, меченными флуоресцентными красителями).

Функциональная валидация генов устойчивости к вредителям:

• Комбинация технологии CRISPR для редактирования генома с флуоресцентной визуализацией для подтверждения ингибирующего действия генов устойчивости к вредителям (например, генов ингибиторов протеазы) на пищеварение насекомых.

 IV. Преимущества технологии

1. Динамическая непрерывность: длительное отслеживание развития болезни или поражения вредителями на одном и том же растении, что исключает влияние индивидуальных различий между особями.
2. Высокая чувствительность: возможность обнаружения инфицирования на ранней стадии (например, поведение патогенов перед заражением, до проникновения через устьица) или улавливания слабых защитных сигналов.
3. Многомерная интеграция: одновременный мониторинг взаимодействия между патогеном, физиологией растения-хозяина и факторами окружающей среды (температура и влажность).

 V. Проблемы и ограничения технологии

1. Ограничения по проницаемости тканей: визуализация толстых тканей (таких как плоды или клубни) или хитиновых покровов насекомых требует применения визуализации в ближнем ИК-диапазоне или оптоакустической визуализации.
2. Риск влияния метки: флуоресцентная маркировка патогенов или насекомых может потенциально изменять их патогенность или поведение (например, экспрессия GFP может влиять на токсичность грибов).
3. Сложность моделирования естественной среды: различия между лабораторными условиями визуализации и естественной средой (например, по освещенности, микрофлоре) могут влиять на достоверность получаемых результатов.
4. Трудности анализа данных: обработка огромных массивов динамических данных (траекторий движения патогенов, моделей поведения вредителей) требует применения алгоритмов искусственного интеллекта, таких как модели отслеживания объектов и классификации поведения.

VI. Перспективные направления развития 

Разработка новых зондов:

• Создание патоген-специфичных зондов (например, флуоресцентно меченных нанотел, нацеленных на конкретные эффекторные белки).
• Развитие методов визуализации без использования меток (например, визуализация на основе Рамановской спектроскопии для прямой идентификации патогенов).

Интеграция мультимодальной визуализации:

• Комбинация методов, таких как микро-КТ и флуоресцентная визуализация, для 3D-реконструкции пространственного распределения патогенов в тканях (например, в клубеньках или стеблях).

Разработка портативных полевых устройств:

• Создание портативных систем для визуализации in vivo, позволяющих осуществлять оперативную диагностику и раннее предупреждение о болезнях и вредителях непосредственно в полевых условиях.

             Технология визуализации in vivo предоставляет всесторонний инструментарий для исследований в области фитопатологии и защиты растений, охватывающий всю цепочку событий — от молекулярных взаимодействий на микроуровне до экологических взаимосвязей на макроуровне. Она вносит значительный вклад в расшифровку механизмов устойчивости к болезням и вредителям, а также в разработку стратегий экологически безопасной защиты растений. Несмотря на существующие технологические ограничения, прогресс в области создания зондов, совершенствования оборудования для визуализации и методов анализа данных будет и дальше расширять границы ее применения, обеспечивая ключевую технологическую поддержку для устойчивого развития сельского хозяйства.

             Технология визуализации in vivo (Live Imaging) как неинвазивный метод динамического мониторинга в реальном времени играет важную роль в исследованиях устойчивости растений к стрессам и селекции. Путем комбинации оптической визуализации, флуоресцентного мечения, геномного редактирования и других технологий она позволяет исследователям визуально наблюдать физиолого-биохимические процессы, динамику экспрессии генов и изменения морфологической структуры в растении, не нарушая его естественного роста. Ниже представлены конкретные области применения и преимущества данного метода в исследованиях устойчивости растений к стрессам и селекции:

I. Применение в исследованиях устойчивости растений к стрессам

1. Мониторинг в реальном времени экспрессии генов, связанных с устойчивостью к стрессам

• Использование флуоресцентных репортерных генов (GFP, люцифераза) для мечения генов, участвующих в реакции на стресс (например, транскрипционные факторы DREB, NAC, WRKY), с целью отслеживания пространственно-временных паттернов их экспрессии в условиях засухи, засоления, низких температур и других стрессоров.
• Пример: Наблюдение с помощью визуализации in vivo за динамическим ответом ключевых генов в сигнальном пути абсцизовой кислоты (ABA) для анализа молекулярных механизмов реакции растений на водный стресс.

2. Динамическая визуализация физиолого-биохимических процессов

• Мониторинг таких физиологических показателей, как накопление активных форм кислорода (ROS), ионные потоки (например, колебания Ca²⁺), изменения pH, что позволяет выявить ранние сигналы ответа растения на неблагоприятные условия.
• Пример: Применение флуоресцентных зондов (например, H2DCFDA для детекции ROS) в сочетании с конфокальной микроскопией для наблюдения в реальном времени за всплеском накопления ROS в кончиках корней при солевом стрессе.

3. Пространственно-временной анализ механизмов стрессового ответа

• Использование технологии визуализации in vivo для отслеживания динамических изменений органов растений (кончики корней, устьица листьев) под воздействием стресса, например, перестройки структуры корневой системы или поведения открытия/закрытия устьиц.
• Пример: применение микро-КТ или лазерного сканирования для анализа процесса ремоделирования трехмерной структуры корневой системы в условиях засухи.

4. Исследование взаимодействия с патогенами и устойчивости к болезням

• Динамический мониторинг процесса инфицирования патогенами и иммунного ответа растения (такого как HR-опосредованная гибель клеток, отложение каллозы) с помощью мечения патогенов (например, флуоресцентно меченные псевдомонады) или белков, связанных с иммунитетом растений.
• Пример: визуализация in vivo для выявления пространственно-временных паттернов активации PTI (иммунного ответа, запускаемого PAMP) у резуховидки Таля.

II. Применение в селекции растений

1. Феномика и быстрый скрининг хозяйственно-ценных признаков

• Системы высокопроизводительной визуализации in vivo (например, PhenoCam, гиперспектральная визуализация) в сочетании с анализом на основе искусственного интеллекта позволяют осуществлять неинвазивный скрининг стрессоустойчивых признаков (засухоустойчивость, эффективность фотосинтеза) в крупных популяциях растений.
• Пример: быстрая идентификация сортов риса с высокой фотосинтетической способностью с помощью визуализации флуоресценции хлорофилла.

2. Оптимизация структуры корневой системы и эффективности использования питательных веществ

• Применение рентгеновской компьютерной томографии (X-ray CT) или магнитно-резонансной томографии (МРТ) для динамического мониторинга роста корней с целью отбора генотипов с высокой эффективностью поглощения воды и питательных веществ.
• Пример: в селекции пшеницы использование визуализации in vivo для отбора засухоустойчивых сортов с глубоко развитой корневой системой.

3. Валидация эффективности геномного редактирования в реальном времени

• Функциональная валидация подвергнутых редактированию с помощью CRISPR/Cas9 генов устойчивости к стрессам (например, OsNAC14) методами визуализации in vivo, например, путем наблюдения за выживаемостью трансгенных растений в условиях стресса или накопления метаболитов.
• Пример: использование флуоресцентно меченных промоторов, управляющих экспрессией генов солеустойчивости, для мониторинга в реальном времени корреляции между силой их экспрессии и фенотипом растения в условиях солевого стресса.

4. Динамическое исследование развития и прорастания семян

• Технология визуализации in vivo позволяет отслеживать активность зародыша, метаболизм запасных веществ и стрессовые реакции в процессе прорастания семян, что дает основу для выведения сортов с высокой всхожестью.