Уже в первые два десятилетия XX века и даже раньше, в XIX веке, ученые обнаружили, что фокусировка на относительно простых организмах позволяет частично разрешить загадки явлений развития. Например, при раскрытии законов наследственности в живой природе Мендель использовал в качестве экспериментального материала горох, а Морган выбрал плодовую мушку дрозофилу. В их исследованиях горох и дрозофила имели меньше клеток, их структура была более однородной, а изменения было легче наблюдать.

            В результате эволюции клеточные формы жизни обладают значительным сходством в фундаментальных моделях развития, и многие базовые механизмы жизнедеятельности схожи у различных биологических видов на Земле. Поэтому возможно использование видов, находящихся на относительно низких ступенях лестницы биологической сложности, для изучения общих закономерностей развития. Это особенно верно, когда общие характеристики морфогенеза и изменений обнаруживаются у организмов с различными особенностями развития, что позволяет установить универсальные принципы развития. Изучение таких организмов помогает нам раскрыть те или иные универсальные закономерности жизненных явлений и понять общие законы, управляющие живым миром. Таким образом, эти специально отобранные организмы и получили название «модельные организмы». Выбор конкретного организма в качестве модельного зависит, прежде всего, от научной задачи, которую ставит перед собой исследователь, а также от поиска вида, наиболее подходящего для решения этой задачи.

            В начале XX века Морган выбрал плодовую мушку Drosophila melanogaster в качестве объекта исследования. На основе этих работ была создана хромосомная теория наследственности, заложившая фундамент классической генетики и положившая начало использованию дрозофилы в качестве модельного организма. Ученые не только подтвердили на дрозофиле законы Менделя, но и открыли сцепленное с полом наследование мутации белых глаз, сформулировали принцип линейного расположения генов в хромосомах и закон сцепления и кроссинговера. В 1933 году Морган был удостоен Нобелевской премии за эти достижения. Расшифровка генома дрозофилы, завершенная в 2000 году, укрепила ее статус в качестве важнейшего модельного животного для изучения генетики и биологии развития.

            С 1965 года ученый Сидней Бреннер ввел нематоду Caenorhabditis elegans в сферу исследований молекулярной и биологии развития. В 1983 году была полностью описана клеточная линия червя от оплодотворенной яйцеклетки до взрослой особи, что стало вехой в истории биологии развития. Впоследствии C. elegans нашла широкое применение в исследованиях эмбрионального развития, определения пола, апоптоза, поведения и нейробиологии, а также стала важнейшим модельным организмом в изучении старения и продолжительности жизни.

            Данио-рерио , обладает такими характеристиками, как высокая плодовитость, внешнее оплодотворение и развитие, прозрачность эмбрионов, короткий цикл достижения половой зрелости, малые размеры и простота содержания, что делает ее идеальным выбором для изучения механизмов эмбрионального развития, функций генов и патогенеза заболеваний. Гладкая шпорцевая лягушка. Ее ооциты отличаются крупными размерами и большим количеством, что удобно для микрохирургических манипуляций. Кроме того, из них можно создавать биологически активные бесклеточные системы, пригодные для биохимического анализа, что обеспечивает им незаменимую роль в исследованиях биологии развития.

            Главным модельным животным, безусловно, является лабораторная мышь! Благодаря своим небольшим размерам, покладистому характеру, простоте в содержании, а также сходству процессов развития и анатомического строения тканей с человеческими, мыши начали использоваться в анатомии и экспериментах на животных еще с XVII века. В результате длительной селекции и разведения в искусственных условиях к настоящему времени выведены тысячи независимых аутбредных и инбредных линий. Лабораторная мышь стала важнейшим модельным организмом для расшифровки функций человеческих генов и изучения болезней человека, а также наиболее подробно изученным млекопитающим в мире для научных экспериментов. Кроме того, гены мыши обладают высокой степенью гомологии с генами человека: 99% генов человека имеют соответствующие гены в геноме мыши. Мышь широко используется в качестве модельного организма в биомедицинских исследованиях и является наиболее детально изученным млекопитающим для экспериментов в современном мире.

            Выше были представлены модельные организмы из царства животных, которые мы обычно называем модельными животными. Существуют ли также модельные растения? Ответ утвердительный. В современных ботанических исследованиях в качестве модельных растений наиболее часто используются резуховидка Таля, табак, томат, рис и другие, причем каждый из них служит своим особым исследовательским целям.

            Открывает ряд модельных растений резуховидка Таля. Она принадлежит к отделу покрытосеменных, классу двудольных и является представителем семейства крестоцветных. Само по себе это растение не обладает большой экономической ценностью. Однако его малые размеры, высокая семенная продуктивность и короткий жизненный цикл; хорошо различимые морфологические признаки, удобные для наблюдения мутантные фенотипы, а также самоопыляемость делают его исключительно удобным объектом. Геном резуховидки Таля считается небольшим для высших растений (около 125 миллионов пар оснований и 5 пар хромосом), гены характеризуются высокой степенью гомозиготности. Обработка физико-химическими факторами приводит к высокой частоте мутаций, что позволяет легко получать мутанты с дефектами различных метаболических функций. Благодаря этому резуховидка Таля стала идеальным модельным организмом для изучения генетики, клеточного развития и молекулярной биологии цветковых растений, заслужив среди ученых титул «дрозофилы в мире растений».

            История изучения резуховидки Таля восходит к XVI веку. В 1943 году Лайбах подробно обосновал ее преимущества в качестве модельного организма, что способствовало проведению первой Международной конференции по резуховидке Таля в Германии в 1965 году. Однако ее активное использование в качестве модельного организма началось примерно в последние двадцать лет того века. В 1986 году лаборатория Мейровица впервые сообщила о клонировании гена резуховидки Таля. В 1988 году была опубликована первая RFLP-карта ее генома. В последующие несколько лет последовали сообщения о клонировании генов мутантов с T-ДНК-вставками и клонировании генов на основе генетических карт. В 2000 году была завершена работа по определению полной нуклеотидной последовательности ее генома, сделав резуховидку Таля первым растением с полностью расшифрованным геномом.

            Томат, или помидор, — это однолетнее или многолетнее травянистое растение семейства пасленовых, рода Solanum. Высота растения составляет 0.6–2 метра, вся его поверхность покрыта липкими железистыми волосками, и оно обладает сильным характерным запахом. Стебель склонен к полеганию. Листья перисто-сложные или перисто-рассеченные. Длина цветоноса — 2–5 см, соцветие обычно состоит из 3–7 цветков. Чашечка и венчик колесовидные. Плод — сочная мясистая ягода, сплюснуто-шаровидной или почти шаровидной формы, с желтыми семенами. Период цветения и плодоношения приходится на лето и осень. Благодаря относительно небольшому размеру генома, короткому жизненному циклу, способности к самоопылению, наличию хорошо отработанной системы генетической трансформации и ясной генетической базе, а также более отдаленному родству с другими модельными растениями (такими как резуховидка Таля или рис), томат стал классическим модельным организмом для изучения процессов развития и созревания плодов.

            Рис, как одна из важнейших зерновых культур в мире, играет все более значимую роль в качестве модельного растения для изучения злаков. Это обусловлено его относительно небольшим геномом, известной геномной последовательностью, хорошо отработанной системой Agrobacterium-опосредованной генетической трансформации, а также высокой степенью гомологии (генетического сходства) с другими зерновыми культурами. Табак — это не только важная экономическая культура, но и один из наиболее ценных материалов для научных исследований. Многие инновационные исследования проводились именно на табаке. Значительная часть ботанических знаний, таких как фотопериодизм, питание растений, фотосинтез, фотодыхание, органический метаболизм, а также исследования вирусов и трансгенных организмов, получена именно из табака. Ни одно другое растение не было изучено наукой так глубоко, как табак. Он является модельным организмом для молекулярной биологии и генной инженерии и по праву заслужил титул «лабораторной мыши растительного царства».

            Помимо упомянутых выше модельных животных и растений, в семейство модельных организмов, конечно же, входят и микроорганизмы. Кишечная палочка и дрожжи являются ключевыми материалами для изучения генетики микроорганизмов и широко используются в качестве модельных организмов в микробиологических исследованиях. В будущем, по мере развития исследований в области наук о жизни, семейство модельных организмов, несомненно, будет продолжать расти.

Основные этапы эксперимента по оптической визуализации визуализации мышей in vivo

             Оптическая визуализация in vivo у лабораторных животных, в частности мышей, в основном основывается на двух технологиях: биолюминесценции и флуоресценции. Биолюминесценция предполагает мечение клеток или ДНК геном люциферазы (Luciferase), в то время как флуоресцентная технология использует для мечения флуоресцентные репортерные гены (например, зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок), флуорофоры (такие как FITC, Cy5, Cy7) и квантовые точки (quantumdot, QD).

• Подготовка лабораторных животных: выбор линии мышей, соответствующей целям эксперимента, проведение необходимой акклиматизации и адаптации к условиям содержания.
• Введение флуоресцентного зонда или биолюминесцентной метки: в соответствии с целями исследования подбирается подходящий флуоресцентный зонд или биолюминесцентный маркер, который вводится подопытному животному.
• Предварительная подготовка к визуализации: перед началом процедуры визуализации необходимо выполнить подготовку животного, такую как очистка шерсти, фиксация в требуемом положении, для обеспечения точности и воспроизводимости результатов.
• Проведение визуализации: в зависимости от выбранной технологии визуализации in vivo, меченое животное помещается в соответствующее оборудование для визуализации. Во время процедуры необходимо контролировать параметры окружающей среды (температуру, влажность и др.) для обеспечения качества изображения и соблюдения принципов биоэтики.
• Анализ и интерпретация данных: после получения изображений проводится анализ данных. Результаты оцениваются и интерпретируются в контексте проекта эксперимента и поставленных исследовательских задач.

 Основные методы мечения в технологии оптической визуализации in vivo у лабораторных животных

Принцип оптической визуализации in vivo у мышей

             Технология визуализации мелких лабораторных животных in vivo основана на использовании высокочувствительной охлаждаемой ПЗС-камеры в сочетании со специальной светонепроницаемой камерой и программным обеспечением для обработки изображений. Это позволяет непосредственно наблюдать за активностью клеток и экспрессией генов в живом организме. Путем регистрации данных от одной и той же группы подопытных объектов в различные моменты времени отслеживаются перемещения и изменения единой цели наблюдения (меченых клеток и генов). Метод отличается простотой выполнения, наглядностью получаемых результатов и высокой чувствительностью, и широко применяется в различных областях, включая науки о жизни, медицинские исследования и разработку лекарственных средств. В области онкологии: создание моделей опухолей позволяет с помощью визуализации in vivo измерять рост и метастазирование опухоли, а также ее реакцию на лекарственные препараты, что приближает онкологические исследования к микросреде клинического заболевания. По сравнению с традиционными методами, этот подход не только повышает чувствительность (позволяя обнаруживать микроскопические очаги опухоли), но и подходит для количественного анализа роста опухоли in vivo, исключая межиндивидуальные различия, возникающие при необходимости умерщвления животных для анализа. В исследованиях лекарственных средств: с помощью визуализации in vivo можно изучать гены, связанные с метаболизмом лекарств, пути их действия, а также органы-мишени и закономерности распределения препаратов в организме.

             Технология оптической визуализация in vivo стала мощным инструментом как в фундаментальных биомедицинских исследованиях, так и в медицинской диагностике. Путем отслеживания и регистрации данных от одной и той же группы объектов в различные моменты времени, эта технология способствует более удобному и эффективному пониманию закономерностей возникновения и развития заболеваний человека, а также исследованию методов их профилактики и лечения. Данная технология уже широко применяется в таких областях, как онкология, фармакологические исследования, генная терапия, изучение апоптоза и эпидемиология.

Рис. 1. Принцип свечения при визуализации in vivo

Рисунок 1. Использование люциферазы (Luciferase) для мечения генов, клеток и живых организмов. Люцифераза, белок, экспрессируемый геном люциферазы и субстрат флуоресцеина в присутствии кислорода, Mg²⁺ и АТФ вступают в реакцию окисления, преобразуя часть химической энергии в световую. Это свечение регистрируется снаружи высокочувствительной ПЗС-камерой для формирования изображения. Однократная инъекция флуоресцеина лабораторной мыши позволяет поддерживать свечение клеток, меченных люциферазой, в её организме в течение 30-45 минут.

1. Оценка фармакодинамики противоопухолевых препаратов in vivo на примере онколитического вируса. Онколитический вирус болезни Ньюкасла (NDV) на протяжении десятилетий применяется в онколитической терапии благодаря своим природным онколитическим свойствам. α2,6-связанная сиаловая кислота играет ключевую роль в связывании NDV и инфицировании опухолевых клеток. В статье, опубликованной Li, Q. и соавт. в 2017 году ^[1], NDV был мечен люциферазой. Эксперименты по визуализации in vivo продемонстрировали, что NDV обладает выраженным противоопухолевым действием против клеток колоректального рака SW620 с высоким уровнем экспрессии α2,6-сиаловой кислоты на поверхности клеток, в то время как его действие на клетки SW480 с обычным уровнем экспрессии α2,6-сиаловой кислоты было незначительным.

Рис. 2. После подкожной имплантации опухолевых клеток SW620 и SW480 мышам проводилась обработка PBS и rNDV-Luci. В группе, обработанной rNDV-Luci, наблюдался интенсивный флуоресцентный сигнал в области опухоли

2. Исследования механизма подавления роста опухоли путем сайленсинга генов показали, что COPB2 значительно сверхэкспрессирован в клеточных линиях рака желудка. В работе An, C. и соавт. ^[2] было продемонстрировано, что нокаут COPB2 приводит к подавлению сигнального пути RTK и его нижестоящих каскадных молекул, что способствует апоптозу клеток рака желудка и подавлению роста опухоли у голых мышей. Результаты экспериментов по визуализации in vivo показали, что общая интенсивность флуоресценции у мышей, инфицированных Lv-shCOPB2, была достоверно ниже по сравнению с контрольной группой, инфицированной Lv-shRNA.

Рис. 3. Общая интенсивность флуоресценции у мышей, инфицированных Lv-shCOPB2, достоверно ниже по сравнению с контрольной группой, инфицированной Lv-shRNA

3. Поиск новых терапевтических мишеней для лечения рака: Исследовательская группа Фармацевтического факультета Фуданьского университета в статье, опубликованной в 2017 году ^[3], показала, что сверхэкспрессия TIPE2 значительно подавляет пролиферацию клеток 4T1 как in vitro, так и in vivo. TIPE2 увеличивает количество Т-клеток и NK-клеток и снижает MDSCs. TIPE2 повышает производство IFN-γ и TNF-α CD8⁺ Т-клетками и NK-клетками в опухолевом микроокружении, усиливая их цитотоксическую активность. Подавление TIPE2 развития и метастазирования рака молочной железы, вероятно, осуществляется за счет усиления CD8⁺ Т-клеточного и NK-клеточного опосредованного противоопухолевого иммунного ответа. Таким образом, TIPE2 может являться потенциальной терапевтической мишенью для лечения рака молочной железы.

Рис. 4. При подкожной имплантации мышам нормальных клеток 4T1 и клеток 4T1 со сверхэкспрессией TIPE2, у группы животных, получивших клетки со сверхэкспрессией TIPE2, наблюдались значительно меньшие по размеру опухоли, и у них не были выявлены метастазы

4. Исследование эффективности CAR-T-терапии при солидных опухолях: Терапия Т-клетками с химерным антигенным рецептором (CAR-T) демонстрирует ограниченную эффективность в лечении солидных опухолей, что в основном связано с их слабой способностью достигать и проникать в опухолевые очаги. Структурные особенности солидных опухолей, потеря специфических антигенов и сильно иммуносупрессивное окружение представляют собой основные вызовы для CAR-T-терапии при лечении данного типа новообразований. В исследовании, направленном на плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC), мишенью был выбран MUC1 ^[4]. Авторы сконструировали как CAR второго поколения, так и CAR четвертого поколения, способный одновременно выделять IL-22. Проведенные эксперименты in vitro и in vivo показали, что CAR-MUC1-IL-22 Т-клетки обладают более сильной и эффективной цитотоксической активностью в отношении MUC1+ клеток HNSCC по сравнению с обычными CAR-Т клетками. Эти результаты указывают на потенциальную эффективность CAR-T-терапии для пациентов с HNSCC и закладывают научную основу для лечения с использованием MUC1+ CAR-T клеток.

Рис. 5. При обработке мышей с моделью HNSCC различными вариантами CAR-T-клеток результаты показали, что CAR четвертого поколения обладает более высокой терапевтической эффективностью по сравнению с CAR второго поколения.

В недавнем исследовании, проведенном совместной командой ученых из Института зоологии Китайской академии наук и Больницы «Сехэ» при Пекинском союзе медиков, с помощью анализа взаимодействий профилей экспрессии генов было обнаружено, что хемокиновый лиганд 20, принадлежащий к группе С-С (CCL)20 имеет высокий уровень экспрессии при раке легких, а также при других видах рака с высокой заболеваемостью и/или смертностью, таких как рак ободочной кишки, рак прямой кишки, рак желудка и рак печени ^[5]. Принудительная экспрессия рецептора хемокина группы C-C 6-го типа (CCR6) привела к миграции CAR-T-клеток к опухолевым клеткам, выделяющим CCL20. В модели мышей с ксенотрансплантатом рака легких CAR-T-клетки с сверхэкспрессией CCR6 после введения эффективно мигрировали и инфильтрировали солидную опухоль, что приводило к эффективной элиминации опухоли и значительному увеличению выживаемости мышей. Результаты данного исследования предоставляют подтверждающие данные для клинической разработки CAR-T-клеток с инженерными хемокиновыми рецепторами в иммунотерапии солидных опухолей.

Рис. 6. Сверхэкспрессия CCR6 в CAR-T-клетках значительно усиливает их миграцию и инфильтрацию в солидные опухоли, что приводит к увеличению выживаемости мышей

Справочные материалы

【1】       Li, Q., Wei, D., Feng,F. et al. α2,6-linked sialic acid serves as a high-affinity receptorfor cancer oncolytic virotherapy with Newcastle disease virus. J CancerRes Clin Oncol 143, 2171–2181 (2017).

【2】       An, C., Li, H., Zhang, X.,Wang, J., Qiang, Y., Ye, X., Li, Q., Guan, Q., Zhou, Y.»Silencing of COPB2inhibits the proliferation of gastric cancer cells and induces apoptosis viasuppression of the RTK signaling pathway». International Journal ofOncology 54.4 (2019): 1195-1208.

【3】       Zhenhua Zhang, Li Liu,Shousong Cao, Yizhun Zhu, Qibing Mei, Gene delivery of TIPE2 inhibits breastcancer development and metastasis via CD8+ T and NK cell-mediated antitumorresponses, Molecular Immunology, Volume 85, 2017, Pages 230-237, ISSN0161-5890.

【4】       Mei, Z, Zhang,K, Lam, AK‐Y, et al. MUC1 as a target for CAR‐T therapy in head and neck squamous cell carinoma. CancerMed. 2020; 9: 640– 652.